Innehåll
Spektrofotometri är ett ovärderligt verktyg inom kemi och biologi. Grundidén är enkel: olika ämnen absorberar ljus / elektromagnetisk strålning bättre vid vissa våglängder än hos andra. Det är därför vissa material är transparenta medan andra är färgade, till exempel. När du lyser med en viss våglängd genom en lösning, desto högre koncentration desto mer ljus absorberar det. För att beräkna koncentrationen måste du jämföra din läsning med avläsningar för standarder för känd koncentration. Proceduren nedan är en ganska generisk procedur skriven med ett kemiundervisningslaboratorium i åtanke, men det kan också ändras för andra inställningar.
Ta alltid på dina skyddsglasögon, handskar och långärmad kappa som alltid när du arbetar i ett labb för att säkerställa din egen säkerhet.
Pressa ut gummilampan för att tömma den från luften, placera den sedan ovanpå din graderade pipett och låt lampan slappna av så att den suger vatten upp i pipetten. Därefter tar du bort glödlampan och täcker toppen av pipetten med fingret. detta tätar pipetten så att lösningen inuti inte rinner ut förrän fingret har tagits bort. Lyft kanten på fingret något så att en liten lösning rinner ut ur pipetten tills du når önskad volym. Öva med lite vatten och en bägare för att få en känsla för hur den graderade pipetten fungerar. Länken under resursavsnittet har ett filmklipp för att visa hur du använder en pipett om du aldrig har arbetat med en tidigare.
Märk 5 provrör som standard 1-5. Du kan märka dem med maskeringstejp och en penna eller med en markör för torr radering.
Välj fem koncentrationer för dina standarder. Du vill att standardkoncentrationerna ska separeras från varandra med ungefär samma intervall - t.ex. 0,1 molar, 0,2 molar, 0,3 molar, etc. - och i ungefär samma intervall som vad du förväntar dig att ditt okända kommer att vara. För närvarande använder du följande fem koncentrationer, men kom ihåg att du måste ändra dessa när du utför ditt eget experiment:
Standard 1: 0.1 molar Standard 2: 0.2 molar Standard 3: 0.3 molar Standard 4: 0.4 molar Standard 5: 0.5 molar
Därefter tar du den 1 molära standardlösningen och tillsätter följande mängder till provrör 1-5. Kom ihåg att dessa mängder beräknas med hjälp av de koncentrationer som anges ovan, så du kan behöva ändra dem efter behov när du utför ditt eget experiment.
Standard 1: 0,8 ml Standard 2: 1,6 ml Standard 3: 2,4 ml Standard 4: 3,2 ml Standard 5: 4 ml
Skölj den graderade pipetten och överför sedan följande mängder avjoniserat vatten:
Standard 1: 7,2 ml Standard 2: 6,4 ml Standard 3: 5,6 ml Standard 4: 4,8 ml Standard 5: 4,0 ml
I princip är tanken att få mängden lösning i varje rör upp till 8 ml.
Täck varje standardrör med parafilm och invertera dem för att blandas.
Markera ytterligare fem provrör som "Okänt 1-5." Lägg till samma mängder av din okända eller testlösning till var och en som du använde med den 1 molära lösningen för standarderna. Med andra ord kommer okänt 1 att innehålla 0,8 ml testlösning och 7,2 ml vatten, okänt 2 kommer att innehålla 1,6 ml testlösning och 6,4 ml vatten, och så vidare.
Täck var och en av de okända med parafilm och invertera försiktigt för att blanda.
Slå på spektrofotometern och låt den värmas upp. Hur lång tid som krävs beror på modellen och tillverkaren.
Ställ in våglängden på spektrofotometern. Våglängden beror på typen av kemikalie i ditt experiment. För närvarande antar du 500 nm, men kom ihåg att du måste ändra detta för olika experiment.
Kalibrera din spektrofotometer. Kalibreringsproceduren kommer att variera beroende på vilken enhet du använder. För Spectronic 20, en vanlig modell i lektionslabor, justerar du först maskinen så att den läser "0 procent T" när ingen kyvett laddas, justerar sedan den så att den läser "100% T" när en tom kyvett innehåller avjoniserad endast vatten laddas. Dessa procedurer kan variera beroende på vilken typ av maskin du använder, så se tillverkarens instruktioner för mer information.
När maskinen är kalibrerad, ta standard 1 provröret och häll innehållet i en ren kyvett tills de når fyllningslinjen. Torka av kyvetten med en kimwipe för att ta bort alla fingrar eller annan smuts. Sätt i kyvetten i spektrofotometern och spela in "% T" -läsningen.
Upprepa den här proceduren för alla 10 prover. VAR VISA för att rengöra kyvetten mellan prover för att se till att dina resultat är så korrekta som möjligt.
Ta resultaten för dina standarder och skriv dem in i ett kalkylblad / grafprogram som Excel eller OpenOffice.
Använd kalkylarkprogrammet och dela 100 procent med var och en av "% T" -värdena för standarderna och ta sedan resultatets logg. Denna beräkning ger dig absorbansen. Om du matar in formeln kommer ditt kalkylprogram att göra beräkningen åt dig.
Exempel: Om% T är 50,6, skulle formeln du matar in i kalkylprogrammet vara följande:
logg (100 / 50,6)
Kalkylarkprogrammet kommer att göra aritmetiken.
Gör samma sak för alla fem okända / experimentella värden.
Grafer absorbansvärdena för alla fem standarder, med koncentration på x-axeln och absorbansen på y-axeln. Använd kalkylarkprogrammet och anpassa en linjär ekvation till denna graf. Ekvationen kommer att ha formen y = mx + b. De flesta kalkylprogram har en linjär regressionsfunktion. Se användarhandboken för ditt kalkylbladsprogram för detaljer om hur du använder den linjära regressionsfunktionen.
Ta ekvationen för den bästa passformen från ditt kalkylbladsprogram och lösa den för y genom att subtrahera b från båda sidor och dela båda sidor med m. Resultatet ser ut enligt följande:
(y - b) / m = x
där b och m är värden som finns i ditt kalkylprogram.
Kontrollera dina absorbansvärden för de okända och välj tre som faller ungefär i samma intervall som standarderna. Använd dessa tre absorbansvärden för dina återstående beräkningar. Om alla fem faller inom samma intervall som standarderna kan du använda alla fem istället, men du måste använda minst tre.
Anslut var och en av de tre absorbansvärdena i din ekvation istället för y. Kom ihåg att din ekvation var i följande form:
(y - b) / m = x
Så du vill ansluta absorbansvärdet för varje okänt till ekvationen i stället för y, beräkna sedan x. Du kan använda kalkylprogrammet för att göra denna beräkning för dig och göra det snabbare. Du har nu beräknat koncentrationen av kemikalien av intresse i tre av dina utspädda okända. Den ursprungliga lösningen späddes emellertid för att bereda dessa okända, men du måste nu arbeta bakåt och beräkna koncentrationen av den ursprungliga lösningen baserat på utspädningsfaktorn.
Varje okänt prov som du satte in i spektrofotometern utspäddes med en annan mängd. Följaktligen bör du nu dela upp koncentrationen du har beräknat baserat på absorbansen för varje okänd avläsning med följande:
Okänt 1: Dela med 0,1 Okänt 2: Dela med 0,2 Okänt 3: Dela med 0,3 Okänt 4: Dela med 0,4 Okänt 5: Dela med 0,5
Kom dock ihåg att dessa siffror bygger på antagandet att du använder de utspädningar som beskrivs ovan. Kom ihåg att ändra dessa värden om du utspädde dina prover med en annan mängd.
Lägg till dina resultat tillsammans och dela dem med antalet resultat. Detta ger dig ett genomsnitt. Rapportera detta nummer som din upptäckt för koncentrationen av den ursprungliga lösningen.