Innehåll
När du arbetar med högpresterande vätskekromatografi (HPLC) är bra kalibrering absolut nödvändig för att säkerställa tillförlitliga kvalitetsresultat. Korrekt kalibrering av ett HPLC-instrument börjar med en lämplig kalibreringsstandard. I de flesta fall kräver kalibrering faktiskt en serie standarder för ökad koncentration för att producera en så kallad kalibreringskurva. Detta är en plottad linje och tillhörande ekvation som beskriver förhållandet mellan koncentrationen av kemikalien som testas för och reaktionen från HPLC-detektorn.
Bestäm kemikalien som du vill testa för att använda HPLC ("analyt"). Till exempel kanske du vill testa en serie läskedrycker med avseende på fruktosinnehåll, i vilket fall fruktose skulle vara analyt.
Skaffa en mängd av analytkemikalien med lämplig renhet. Normalt bör renheten vara över 99% och analyten ska köpas från ett ansedd kemikalieföretag. När det gäller fruktos, till exempel, skulle du köpa ren fruktos från en kemisk leverantör och inte från en livsmedelsbutik.
Bestäm de högsta och lägsta förväntade koncentrationerna av analyt i proverna du tänker testa på HPLC. När det gäller läskedrycker skulle du undersöka dryckernas etiketter och bestämma det lägsta och högsta fruktosinnehållet bland de drycker som du testar. Tänk på att det ursprungliga provet (läskedrycket) kan utspädas eller på annat sätt manipuleras under förberedelserna för analys (beroende på vilken HPLC-metod som används) och så att analytkoncentrationen i proverna som faktiskt injiceras på HPLC kan modifieras. Det är analytkoncentrationen i proverna som körs på HPLC som måste beaktas.
Bestäm lösningsmedlet där du kommer att lösa upp din analyt för att upprätta kalibreringsstandarder. Detta lösningsmedel måste kunna lösa upp analytet på ett relativt brett koncentrationsområde (minst lika högt som i de prov du tänker testa). Dessutom bör detta lösningsmedel idealiskt vara ganska likt den "mobila fasen:" lösningsmedlet som används för att bära prover genom HPLC-instrumentet.
Beräkna mängden analyt som krävs för att göra en "lagerstandard" -lösning av analyt. Detta upptäcks genom att multiplicera den erforderliga koncentrationen av lagerstandarden med den önskade volymen. Koncentrationen av analyt i denna lösning bör vara minst 10% högre än den högsta förväntade provkoncentrationen. Om den högsta förväntade fruktoskoncentrationen i ett läskprov är 8 gram / 100 ml kan stamstandarden göras till en koncentration av 10 gram fruktos / 100 ml. En rimlig volym är 500 ml, vilket innebär att 8/100 ml x 500 ml = 40 gram fruktos krävs.
Väg upp den erforderliga mängden analyt till en lämplig nivå av precision. Ofta är ett viktvärde i gram exakt till en eller två decimaler lämpligt, men mer precision kan behövas för vissa metoder.
Överför den vägda analyt till en volymkolv med den nödvändiga volymen och tillsätt önskat lösningsmedel till fyllningsmärket på kolven. Användning av en volumetrisk kolv (snarare än en graderad bägare, till exempel) ökar precisionen i lagerstandardkoncentrationsvärdet. Se till att all analyt överförs till kolven. använd något av lösningsmedlet för att tvätta det i, om det behövs.
Stoppa den volymetriska kolven och skak försiktigt eller invertera tills analyt är helt upplöst.
Gör en serie med olika utspädningar av stamstandarden genom att överföra kända volymer av stamstandarden till volymkolvar, använd pipetter för exakt överföring och tillsätt sedan lösningsmedel. Den lägsta standardkoncentrationen bör ligga under det lägsta förväntade provet som ska analyseras. I läskexemplet, om den lägsta förväntade fruktoskoncentrationen i ett prov är 2 gram / 100 ml, kan en 1 gram / 100 ml standard göras. Detta skulle göras genom en tiofaldig utspädning av lagerstandarden. Standardserien bör innehålla totalt 5 eller 6 koncentrationer, så ytterligare spädningar för att producera standarder av kanske 3, 5 och 8 gram fruktos / ml skulle krävas. Du har nu en serie standardlösningar för att kalibrera HPLC.