Enligt webbplatsen University of Wisconsins BioWeb är en PCR-primer en kort, syntetisk oligonukleotid (vanligtvis mellan 18 och 25 baser lång) som används för att förstärka specifika regioner av DNA i en molekylärbiologisk teknik känd som polymeraskedjereaktion (PCR). Både en framåtriktad och omvänd primer behövs, utformade för att vara omvänd komplement av DNA-strängen, för att flankera och binda till den önskade DNA-regionen. När forskare vill utföra forskning på en specifik gen eller region av DNA, måste de först utföra PCR för att få tillräckligt med målregionen att arbeta med. Designa primersekvenser för det intressanta området kan vara nödvändigt om de inte redan är tillgängliga genom tidigare publicerad forskning eller med kommersiella medel.
Få nukleotidsekvensen för genen eller DNA-regionen av intresse och bestäm hur länge ett fragment du vill förstärka. Den främre och bakre primern är utformad för att binda i början och i slutet av det önskade fragmentet. Vanligtvis använder konventionella PCR-metoder primers som flankerar ett område mellan 100 till 1 000 baspar långa, medan realtids PCR-metoder använder fragment som är cirka 50 till 200 baspar långa.
Bestäm var i sekvensen du vill att primrarna ska ligga. Till exempel kanske du vill ha platsen nära sekvensen 5 eller 3-änden eller i mitten. Om så önskas, ange platsen för grundarna för att spänna en intron.
Följ de rekommenderade riktlinjerna för grundkonstruktion. Framgångsrik amplifiering av DNA-produkt beror på kvaliteten på primrarna och vissa variabler är kritiska.
Designa primers för att vara 18 till 24 basar i längd. Vincent R. Prezioso, Ph.D., från Brinkmann Instruments Inc., föreslår att denna längd är tillräckligt lång för att vara extremt specifik för den önskade DNA-regionen, men tillräckligt kort för att lätt binda (glödgas). Primer smälttemperatur (Tm) bör vara mellan 55 till 80 grader Celsius, tillräckligt låg för att möjliggöra fullständig smältning vid eller över 90 grader Celsius, men tillräckligt hög för att möjliggöra glödgning. GC-innehållet (procent av Gs och Cs i sekvensen) bör vara mellan 40 och 60 procent. 3-änden av primersekvensen bör sluta i en C eller en G (kallad en GC-klämma) för att främja bindning, eftersom G- och C-nukleotiderna har starkare bindningar, men undvik att ha tre eller flera Gs eller Cs under de senaste fem baserna av sekvensen.
Undvik att ha körningar med fyra eller flera av en bas (som ACCCC ...) eller fyra eller flera repetitioner av di-nukleotider (som ATATATAT ...) eftersom de kan orsaka felaktig primning.Designa primers utan intra-primer-homologi (mer än tre baser som kompletterar i den ena primern) eller inter-primer-homologi (där den främre och bakre primern har kompletterande sekvenser). Detta kan orsaka självdimerer eller primer-dimerer, där primrarna binder till sig själva istället för att binda till den önskade DNA-sekvensen.
Använd resurser och webbplatser på nätet som hjälper till med design av grundläggare eller hjälper till att kontrollera primersekvenser för självkomplementaritet eller potential att skapa sekundära strukturer som hårnålar. Vissa webbplatser för grundläggande design inkluderar Massachusetts Institute of Technologys Primer3, National Center for Biotechnology Information Primer-Blast och Integrated DNA Technologies OligoAnalyzer.