Innehåll
Gelelektrofores är en teknik som gör det möjligt att analysera DNA på nivån av dess beståndsdelande molekyler. I denna DNA-visualiseringsmetod placeras prover på ett agarosgelmedium och ett elektriskt fält appliceras på gelén. Detta får fragment av DNA att migrera genom gelén med olika hastigheter i enlighet med deras elektrokemiska egenskaper.
Etidiumbromid
För denna visualiseringsteknik blandas etidiumbromid med agarospulver, EDTA-buffert och vatten för att bilda gelmatrisen innan elektrofores. Som ett resultat blir etidiumbromidmolekylerna enhetligt spridda över hela matrisen. När gelbrunnarna har fyllts med sina respektive DNA-prover och spårningsfärger appliceras spänning för att långsamt dra de stora, polära föreningarna över matrisen.
Under denna rörelse binder DNA-molekylernas baser tillfälligt till partiklarna tack vare etidiumbromidladdningen och drar dem med. När gelelektroforesen är klar har varje DNA-molekyl plockats upp vid en betydande mängd etidiumbromid.
I närvaro av ultraviolett ljus uppvisar etidiumbromid fluorescens. Tekniker lyser ett speciellt kalibrerat UV-ljus över gelén medan en maskin fångar bilden av de glödande fragmenten.
Metylenblå
Om en UV-transilluminator inte är tillgänglig eller praktisk, kan tekniker göra DNA synligt under normalt skick genom att blötlägga den färdiga agarosgelen med elektroforesiserat DNA inuti, i en lösning av metylenblått över natten.
Ett kloridsalt med en signifikant hydrofob anjon, metylenblå molekyler penetrerar hela gelmatrisen. Vätebindningen genom DNA får dock fläckmolekylerna att ackumuleras. Denna ökade DNA-fläcktäthet ger en djupare nyans av blått, synligt för det blotta ögat.
Spåra färgämnen
Utöver DNA-bandets relativa storlek kan tekniker mäta den absoluta storleken (i baspar) för varje fragment med kemikalier som kallas spårningsfärgämnen. Synligt utan tillsats av metylenblått eller etidiumbromid, spårningsfärger såsom bromfenolblått och xylencyanol rör sig över aragosgelmatriserna under elektrofores med samma hastighet som DNA-fragment bestående av 300 nukleotider respektive 4 000 nukleotider. Vid elektrofores rör sig mer massiva DNA-fragment över gelmatrisen med en lägre hastighet än mindre fragment. Därför, medan spårningsfärgämnen inte direkt påverkar synligheten för DNA-fragment, gör jämförelsen av ett DNA-fragment i gelén med läget för dessa färgämnen tekniker att "se" det ungefärliga antalet nukleotider som DNA-fragmentet innehåller.