Innehåll
Gram-fläcken är en differentiell färgningsprocedur som visar vilka bakterier som är Gram-positiva eller Gram-negativa baserat på deras färgfärg. Acetonalkohol är ett reagens som används i denna process för att ge färgdifferentiering. Gram-positiva bakterier har ett tjockt peptidoglykansk skikt och färgar lila, medan gram-negativa mikroorganismer har lite till inget peptidoglykansk skikt och rosa färg.
Primär Stain-Crystal Violet
När en bild av bakterieprov har framställts används kristallviolett för att först färga provet. Vid denna punkt kommer både Gram-positiva och Gram-negativa bakterier att visas lila. Vanligtvis appliceras kristallfiolett på objektglaset i 30 sekunder innan du tvättar bort överflödigt fläck med vatten. Kristallviolet kan fästa sig lite till peptidoglykanlagren så att inte alla primära fläckar kommer att tvättas bort med vattnet.
Mordant-Jod
Jod tillsättes sedan till provet under en minut. Det fungerar som en mordant, som tjänar till att fixa färgämnen i en färgningsprocess. Jod utför denna funktion genom att binda till den kristallvioletta och skapa ett olösligt komplex som vidhäftar mycket bättre det tjocka peptidoglykanskiktet som finns i grampositiva bakterieceller än bara kristallvioleten. Det finns inte ett tvättsteg med vatten efter tillsats av jod.
Avfärgaren-alkohol
Antingen kan aceton eller etylalkohol användas som avfärgningsmedel. Alkoholen löser upp lipider som finns i det yttre cellmembranet av gramnegativa bakterier, vilket gör att kristallviolett jodkomplexet läcker ut ur det tunnare peptidoglykanskiktet. Alkoholen tillsätts under 10 till 20 sekunder; den hälls på objektglaset tills all jod har tvättats bort och avströmningen är färglös. Vid denna punkt i Gram-fläckprocessen är Gram-negativa bakterier färglösa medan Gram-positiva bakterier fortfarande behåller kristallviolet. När bilden är klar måste sköljas med vatten för att stoppa avfärgningseffekten.
Motfärg-Safranin
Safranin tillsätts sedan för att öka synligheten och kontrasten till de färglösa gramnegativa bakterierna. Fläcken gör att dessa bakterier verkar rosa under mikroskopet. Eftersom fläcken läggs till hela provet, färgar den också grampositiva bakterier, men den mörkare kristallviolet döljer den ljusare safraninrosa färgen. När glidprovet har översvämmats med safranin i ungefär en minut, används vatten för att tvätta bort överflödigt fläck som inte fäster vid bakteriecellerna.