Innehåll
Vid kemiska reaktioner katalyserade av ett enzym sänker enzymet mängden aktiveringsenergi som krävs genom att tillfälligt binda till substratet och vrida det till ett ansträngt tillstånd. K (katalysator) eller "kcat" för reaktionen hänför sig till den koncentrationsoberoende konstanten för den hastighet med vilken ett specifikt enzym kan metabolisera ett substrat till en produktmolekyl. För att beräkna kcat blandar forskare först flera provrör med varierande koncentrationer av substrat (känd som en "enzymatisk analys") och testar dem med konstant tidsintervall med en ljus spektrofotometer för att mäta de växande koncentrationerna av produktmolekyler. Dessa data plottas sedan på en graf och analyseras.
Beräkna initiala hastigheter
Plotta ett diagram över produktkoncentration kontra tid för data från de enzymatiska analyserna första provröret. Obs: den horisontella axeln ska vara "tid" och den vertikala axeln ska vara "produktkoncentration."
Beräkna den linjära regressionslinjen för de datapunkter som du plottade i avsnitt 1, steg 1. Medan Excel och grafiska kalkylatorer enkelt kan bestämma den här linjära modellen, kan du härleda en uppskattning av regressionslinjens lutning genom att dela skillnaden i produktkoncentration mellan intilliggande data poäng efter deras tidsskillnad.
Spela in lutningen för den linjära regressionslinjen från avsnitt 1, steg 2 som "initial reaktionshastighet (Vo)." Obs: i regressionslinjemodellen "= m + b" är "koefficienten" m lutningen.
Upprepa steg 1, 2 och 3 för resten av provrören i analysen.
Beräkning av Vmax
Rita in det inversa av substratkoncentrationen för varje provrör kontra det inversa av dess initiala reaktionshastighet (från avsnitt 1, steg 4). Om till exempel hastigheten för ett provrör med en initial substratkoncentration på 50 mikromolär (uM) var 80 uM / s skulle inverserna vara 1/50 uM för substratkoncentrationen och 1/80 uM / s för den initiala hastighet. Obs: den omvända substratkoncentrationen bör ligga på den horisontella axeln och den omvända initiala hastigheten ska vara på den vertikala axeln.
Obs: substratkoncentrationen ska ligga på den horisontella axeln och den initiala reaktionshastigheten bör vara på den vertikala axeln.
Bestäm den linjära regressionslinjen för diagrammet som du ritade i avsnitt 2, steg 1. Obs: eftersom du måste känna till y-skärningspunkten för regressionslinjen bör du ange punkterna från avsnitt 2, steg 1 i antingen Excel eller en grafiska kalkylatorn och använda den inbyggda regressionsmodelleringsfunktionen.
Dela 1 med y-skärningen från den linjära regressionslinjen. Detta ger dig värdet på det inverse av Vmax, den maximala reaktionshastigheten för enzymet. Obs: om den linjära regressionsmodellen har formen "= m + b", skulle värdet på "b" vara y-skärningen. Dela 1 med "b" för att beräkna det inversa av Vmax.
Dela 1 med resultatet från avsnitt 2, steg 3 för att beräkna det verkliga värdet på Vmax.
Bestäm koncentrationen av enzymet i den ursprungliga analysen (se rådata). Obs: enzymkoncentrationen är densamma för alla provrör; endast substratkoncentrationerna varierar i analysen.
Dela Vmax (från avsnitt 2, steg 4) med enzymkoncentrationen (från avsnitt 2, steg 5). Resultatet är värdet på Kcat.