Innehåll
Kvantifiera ditt RNA-prov genom att mäta dess absorbans av ultraviolett ljus (UV). En nano-drop-spektrofotometer använder bara en eller två mikroliter av ditt prov, som du kan återställa. Andra spektrofotometrar kräver ett mycket större prov. Utdödningskoefficienten för nukleotider vid en UV-våglängd på 260 nm i en 1 cm ljus väg är 20. Baserat på denna utdödningskoefficient är absorbansen av 40 ug / ml RNA under samma förhållanden en. Med hjälp av denna information kan du beräkna koncentrationen av ditt RNA-prov.
Gör en utspädning, om nödvändigt, av ditt prov. En standardutspädning för en mikrokuvett är 1:40. Gör denna utspädning genom att tillsätta 2 uL RNA-prov till 78 pl sterilt vatten.
Följ protokollen för din speciella spektrofotometer för att kalibrera maskinen med hjälp av ett ämne och bestäm sedan den optiska densiteten för ditt prov vid en UV-våglängd på 260 nm.
Multiplicera absorbansen av ditt prov med din utspädningsfaktor med 40μg RNA / ml. Ekvationen skulle vara: "RNA-koncentration (µg / ml) = (OD260) x (utspädningsfaktor) x (40 ug RNA / ml) / (1 OD260-enhet)" (Hofstra.edu) Exempel: Om du utspädde ditt prov med 1:40 och din absorbansavläsning var 0,08, du skulle multiplicera 0,08 x 40 x 40 = 128 μg / ml = 0,13 μg / μL
Räkna ut ditt provs renhet genom att ta en annan absorbansavläsning vid UV-våglängd på 280 nm. Förhållandet OD 260 / OD 280 kommer att indikera om - och på vilken nivå - ditt prov är förorenat med protein eller fenol. Ett resultat från 1,8 till 2,0 indikerar kvalitets-RNA.