Innehåll
Polymeraskedjereaktion, eller PCR, är en teknik som fotokopierar ett fragment av DNA i många fragment - exponentiellt många. Det första steget i PCR är att värma upp DNA så att den denatureras eller smälter till enstaka strängar. Strukturen hos DNA är som en repstege där rullarna är rep med magnetiska ändar. Magneterna ansluts för att bilda rullarna, kallade baspar, och motstår således att dra isär. Varje DNA-fragment smälter i enstaka strängar vid olika temperaturer. Att förstå hur DNA-strukturen hålls samman av DNA: s enskilda delar ger insikt i varför olika DNA-fragment smälter vid olika temperaturer och varför sådana höga temperaturer behövs i första hand.
Smältande! Smältande!
Det första steget med PCR är att smälta DNA: t så att dubbelsträngat DNA separeras till enkelsträngat DNA. För däggdjurs-DNA involverar detta första steg vanligtvis värme på cirka 95 grader Celcius (cirka 200 Fahrenheit). Vid denna temperatur binder vätebindningarna mellan A-T- och G-C-basparna, eller rullarna i DNA-stegen, varandra och lossar det dubbelsträngade DNA: t. Temperaturen är emellertid inte tillräckligt varm för att bryta fosfat-sockerryggraden som bildar de enstaka strängarna eller stegen. Fullständig separering av enstaka strängar förbereder dem för det andra steget av PCR, som kyls för att tillåta korta DNA-fragment, kallad primers, att binda de enda strängarna.
Magnetiska dragkedjor
En anledning till att DNA värms upp till den höga temperaturen på 95 grader är att ju längre dubbelt DNA-strängen är, desto mer vill det hålla sig tillsammans. DNA-längd är en faktor som påverkar den smältpunkt som valts för PCR på den biten av DNA. A-T- och G-C-basparna i den dubbelsträngade DNA-bindningen med varandra för att hålla dubbelsträngsstrukturen samman. Ju mer i följd baspar mellan två enkelsträngar har bundits, desto mer vill deras grannar också binda, och desto starkare blir attraktionen mellan de två strängarna. Det är som en dragkedja tillverkad av små magneter. När du stänger blixtlåset kommer magneterna naturligtvis att vilja blixtlösa och stanna blixtlösa.
Starkare magneter hålls fastare
En annan faktor som påverkar vilken smälttemperatur att välja för ditt DNA-fragment av intresse är mängden G-C-baspar som finns i det fragmentet. Varje baspar är som två minimagneter som lockar. Ett par av G och C är mycket starkare lockat än ett A- och T-par. Således kommer en bit DNA som har fler G-C-par än ett annat fragment att kräva en högre temperatur innan den smälter i enstaka strängar. DNA absorberar naturligtvis ultraviolett ljus - vid våglängden på 260 nanometer för att vara exakt - och enkelsträngat DNA absorberar mer ljus än dubbelsträngat DNA. Så att mäta mängden absorberat ljus är ett sätt att mäta hur mycket ditt dubbelsträngade DNA har smält i enkla strängar. Den "magnetiska blixtlås" -effekten av G-C- och A-T-baspar är det som får en graf över ljusabsorberingen av dubbelsträngat DNA plottat mot en temperaturökning att vara sigmoidal, formad som en S och inte en rak linje. S-kurvan representerar lagarbetsmotståndet som basparna utövar mot värmen eftersom de inte vill separera.
The Halfway Point
Temperaturen vid vilken en längd av DNA smälter i enstaka strängar kallas dess smälttemperatur, vilken betecknas med förkortningen "Tm." Detta indikerar temperaturen vid vilken hälften av DNA i en lösning har smält till enkla strängar och den andra hälften är fortfarande i dubbelsträngad form. Smälttemperaturen är olika för varje DNA-fragment. Däggdjurs-DNA har ett G-C-innehåll på 40%, vilket innebär att de återstående 60% av basparna är As och Ts. Dess 40% G-C-innehåll får DNA från däggdjur att smälta vid 87 grader Celcius (cirka 189 Fahrenheit). Det är därför det första steget av PCR på däggdjurs-DNA är att värma det till 94 grader Celcius (201 Fahrenheit). Bara sju grader varmare än smälttemperaturen och alla dubbla trådar smälter helt till enstaka trådar.