Innehåll
En cell är genetiskt blått kodat i dess genetiska material, eller DNA. Eftersom DNA aldrig lämnar cellens kärna är det nödvändigt att först transkribera DNA till messenger RNA (mRNA eller poly (A) RNA) för att denna information ska komma in i cytoplasma där andra proteiner och biokemiska komponenter finns. Detta mRNA översätts sedan till proteiner som utför många funktioner i cellen. För att detektera eller kvantifiera mycket sällsynta mRNA, göra sonder för mikroarrayer eller konstruera bibliotek med komplementära DNA-molekyler, mRNA måste isoleras. Emellertid är total RNA (dvs all RNA i en cell) extraktion och efterföljande mRNA-isolering inte ömsesidigt exklusiva processer; det förstnämnda måste utföras för att mRNA ska extraheras.
Isolering av mRNA från total RNA
TRIzol-homogenisering: Totalt RNA inkluderar allt mRNA, överförings-RNA, ribosomalt RNA och andra icke-kodande RNA. För att separera dessa från andra cellkomponenter brister cellen först öppen för att frigöra dess innehåll. Detta görs genom att resuspendera celler som pelleteras genom centrifugering (snurrning med höga hastigheter) i TRIzol-reagens (Life Technologies). Andra versioner av TRIzol (som Ambions TRI-reagens) fungerar på liknande sätt.
Total RNA-isolering: En serie centrifugeringar används för att separera de olika komponenterna (proteiner, DNA, RNA) i cellen i lager eller faser i suspensionen. Den övre gulfärgade fasen består av fett och kan kasseras. Den önskade fasen är tonad röd, innehåller det totala RNA och behålls. Efter utförande av en extraktion med fenol-kloroform och en serie alkohol tvättar med användning av isopropanol och etanol, kan RNA pelleteras för mRNA-isolering. Tillsätt RNase-hämmare för att förhindra att detta enzym försämrar det totala RNA.
mRNA-extraktion: Det är vanligt att använda ett kit för att isolera mRNA, eftersom hemmagjorda laboratorieprotokoll inte genererar stora mängder mycket renade mRNA. Kommersiella kit inkluderar Invitrogen's FastTrack 2.0 eller Ambions Poly (A) Pure mRNA Isolation Kit. Dessa grundläggande steg är vanliga för sådana kit:
a) Blanda den RNas-inhiberade lysbufferten som tillhandahålls i satsen med upp till 300 mikroliter totalt RNA.
b) Värm i 5 minuter vid 65 grader och kyl sedan omedelbart provet på is under en minut.
c) Blanda detta med 0,5M natriumklorid och upplös sedan Oligo dT (oligodeoxythymidylsyra) i detta prov.
d) Centrifugera detta prov och återvinn supernatanten, som tvättas flera gånger i en serie bindnings- och lågsaltbuffertar tillhandahållna i satserna.
e) Eluer mRNA flera gånger tills en kit-specifik volym (t.ex. 500 mikroliter) erhålles.
f) Fällning av eluatet med natriumacetat och etanolutfällning. Återuppslamning i upp till 20 mikroliter dietylpyrokarbonat (DEPC) -behandlat vatten.
g) Förvara vid -80 grader Celsius och kontrollera med avseende på kvalitet och kvantitet med hjälp av spektrofotometri.