Innehåll
Western blotting är en av de vanligaste förfarandena i biokemiska laboratorier. I princip separerar det proteiner från ett prov efter storlek och testar sedan med antikroppar för att bestämma om ett givet protein är närvarande. Det är användbart inte bara i forskning utan också i medicinska eller diagnostiska laboratorier; tester för både HIV och Lyme-sjukdom, till exempel, involverar ett enzymbundet immunosorbent-test (ELISA) -test, följt av en Western blot om ELISA testar positivt. Trots sin popularitet har dock Western blotting flera nackdelar.
Nonquantitative
Klassiska västra blotting är icke-kvantitativa. Med andra ord, medan de kan berätta för forskare om ett visst protein finns, gör de det inte möjligt att kvantifiera hur mycket av proteinet som finns. Vissa bioteknikföretag säljer nu kit som gör det möjligt för forskare eller laboratorietekniker att kvantifiera mängden protein som finns med en standardkurva - men det fungerar bara om rena prover av samma protein finns tillgängliga. Dessutom kan molekylvikten för ett protein endast uppskattas med Western blotting, snarare än bestämmas exakt som med masspektrometri.
antikroppar
En Western blot kan endast utföras om primära antikroppar mot proteinet av intresse är tillgängliga. Även om antikroppar för många olika proteiner är tillgängliga från bioteknikföretag, är de inte billiga; om primära antikroppar inte är tillgängliga för ett givet protein kommer det inte att vara möjligt att utföra en Western blot som letar efter det specifika proteinet. Dessutom kanske forskare vill bestämma om ett protein har modifierats på något sätt - om det har fosforylerats (hade en fosfatgrupp fäst till det), till exempel - och med Western blot-tekniken behöver de antikroppar specifika för den modifierade protein.
Träning
Det kan vara utmanande att utföra en Western blot korrekt och få bra resultat, så personalen måste vara välutbildad.I detta som i mycket annat är erfarenhet kanske den bästa handledaren; även för en erfaren tekniker är dock en Western blot tidskrävande. Gelelektroforesdelen av experimentet, till exempel, kommer vanligtvis att ta från en till två timmar att köra. Andra uppgifter kan naturligtvis utföras medan gelén körs, men experimentet tar fortfarande ganska lång tid att få resultat.
Andra begränsningar
Antikroppar kan ibland uppvisa en viss bindning utanför målet, vilket kan ge sämre resultat. Med Western blotting använder du dessutom en antikropp mot ett specifikt protein, så dina resultat kommer bara att säga om proteinet var närvarande. Högupplöst masspektrometri avslöjar däremot alla proteiner som finns i ett prov, och till skillnad från klassisk Western blotting är den kvantitativ. Det är naturligtvis viktigt att komma ihåg att masspektrometri är mycket dyrare och också mer tekniskt utmanande att använda jämfört med Western blotting.